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Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)是目前电泳法变性分离多肽的主要方法，但是单独配制各种溶液十分繁琐，同时其蛋白回收率低，跟后续质谱分析不兼容，为此本公司在传统Tricine-SDS-PAGE电泳的基础所，进行了改良很升级，并推出本制品。

• 一站式，即开即用，用户不需单独准备各种成分，十分方便。
  
• 安全，免去了实验人员接触粉末状的剧毒物品丙烯酰胺。
  
• 电泳后可直接用于考染、银染、Western杂交等实验。
  
• 分辨率高，只需要两层胶（浓缩胶和分离胶）就可以达到过去三层胶的效果（浓缩胶、隔离胶和分离胶）。
  
• 蛋白片段的回收率比常规Tricine-SDS-PAGE高。
  
• 纯化的蛋白可以用于后续的质谱分析。
  
• 本试剂盒只能用于科研。

• 配制30%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液(29∶1，下面简称为AB溶液)：直接在装有60克丙烯酰胺和3克甲叉双丙烯酰胺的瓶中加入140mL自备的去离子水，拧紧瓶盖后37℃水浴，其间颠倒摇晃多次，直到干粉全部溶解，得到30% AB溶液(99∶1)，该溶液最好4℃避光保存，在一个月内用完。AB溶液具有神经毒性，一定要戴手套操作。
  
• 配制3%的APS（过硫酸铵）：按每30mg过硫酸铵干粉加1mL去离子水的比例将去离子水加到装有硫酸铵干粉的1.5mL EP管中，摇晃到粉末全部溶解。此溶液必须现配现用。过硫酸铵极其容易吸潮，没用完的过硫酸铵一定要拧紧盖子。如果吸潮，可用自备的分析纯过硫酸铵替代。
  
• 配制10×Tricine-SDS-PAGE电泳液：在烧杯中加入约800mL去离子水，然后加入本试剂盒提供的约80g Tricine-SDS-PAGE电泳液干粉，65℃加热搅拌溶解，用去离子水定容到1000mL。每次使用时用去离子水稀释10倍即得1×Tricine-SDS-PAGE电泳液。
  
• 配制30mL 10%分离胶（足够灌两块0.75mm×14cm×14cm胶）。
  
  • 标记1个50mL的三角瓶，按下表的用量加入各成分：
    

    成分	用量
    30% AB溶液(29∶1)	10mL
    Tricine-SDS-PAGE配胶液	16.8mL
    离子水	2.7mL

  • 混匀后真空脱气10～15分钟。
    
  • 灌分离胶：在分离胶瓶中加入450μL 3%的APS溶液和18μL TEMED溶液，轻轻旋转混匀。用吸管将分离胶溶液沿着一个隔条的边缘加到玻璃板夹层中，直到溶液的高度距离玻璃上沿还有1cm。
    
  • 盖1cm高的自备水饱和的异丁醇或70%乙醇使胶面跟氧气隔绝（氧气会抑制胶的凝固）。让分离胶在室温聚合30～45分钟。
• 配制10mL 4%浓缩胶（足够灌两块0.75mm×14cm×14cm胶）。
  
  • 在一个50mL的三角瓶中，先按下表的用量加入各成分：
    

    成分	用量
    30%AB溶液(29∶1)	1.32mL
    Tricine-SDS-PAGE配胶液	1.52mL
    离子水	6.85mL

  • 混匀后真空脱气10～15min。
    
  • 将300μL新鲜配制的3%的过硫酸铵溶液和10μL TEMED溶液加入到溶液中，轻轻旋转混匀。用吸管将积层胶溶液缓缓地沿着一侧隔条边缘加入到玻璃平板夹层中，直到夹层中的溶液离玻璃板顶部约1cm高为止。
    
  • 插入0.75mm厚的塑料梳子，再补加浓缩胶溶液填满梳子间的空隙。
    
    • 避免产生气泡。让浓缩胶在室温聚合30～45分钟。
• 小心拔出塑料梳子，在上层和下层缓冲槽中加入1×Tricine-SDS-PAGE电泳液，并用其冲洗加样孔，去除没有凝聚的丙烯酰胺溶液。
  
  • 本制品提供10升的电泳液干粉，将所有干粉溶解在600～800mL去离子水中，最后定容到1000mL即得10×电泳液，可以室温放置，不需要灭菌，用时再用去离子水稀释10倍成1×电泳液。
• 在密封的螺盖微量离心管中，用2×Tricine-SDS-PAGE上样缓冲液按1∶1的比例稀释蛋白样品，于0℃加热10分钟。
  
  • 如果样品是蛋白沉淀物，则加入100μL新稀释得到的1×Tricine-SDS-PAGE上样缓冲液溶解；如果样品是蛋白稀溶液，蛋白浓度过低，可先浓缩蛋白质再溶解。
    
  • 与Tricine-SDS-PAGE上样缓冲液混合后的样品如未经70℃加热灭活蛋白酶，切勿放于室温。
• 上样。如果后续用考马斯亮蓝染色，对于成分复杂的蛋白质样品，上样量最好为20μL（含25～50μg总蛋白质）；对于只有一种或几种蛋白质的样品，上样量最好为1～10μL。如果用银染，上样量可减少10～100倍。
  
• 电泳。125～150V恒压电泳直到电泳指示剂到达胶板的边缘。一般需要4～5h。
  
  • 本制品的Tricine-SDS-PAGE上样液使用了考马斯亮蓝G-250作为指示剂，其泳动速度比最小的肽还快。
• 终止电泳，取出凝胶进行后续的实验处理（最好用银染染色，节约样品）。
  
  • 考染或银染时，基本步骤同蛋白PAGE胶染色，只是任何一步（尤其是固定步骤）的处理时间都不要超过20分钟，否则多肽非常容易扩散出PAGE胶而降低检测的灵敏度。